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    本發明關於一種具有優異免疫抑制活性的單株抗體或其抗原結合片斷。更詳細而言，本發明關於一種單株抗體或其抗原結合片斷，其係由SSVLYGGPPSAA(序列編號1)所表示之胺基酸序列所構成之胜肽或該胜肽與藥學上可容許的載體之結合體結合之單株抗體或其抗原結合片斷，而對於核心組織蛋白的結合親和性高於對於組織蛋白H1的結合親和性。
    公开号:TW201300416A
    申请号:TW100129738
    申请日:2011-08-19
    公开日:2013-01-01
    发明作者:Shuji Sato；Takeshi Goto；Shigeru Goto；Toshiaki Nakano；Naoya Ohmori；Kueichen Chiang；Yayoi Shimada；Kenji Mori；Takamitsu Miyagi
    申请人:Josai University Corp；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    具有免疫抑制活性的單株抗體或其抗原結合片斷關連申請的參照
    本專利申請基於2010年8月20日所申請的日本專利申請2010-185406號，而連帶主張優先權，在該先前專利申請中全部的揭示內容因為引用而被視為本說明書揭示的一部分。
    本發明關於一種具有優異免疫抑制活性的單株抗體、或其抗原結合片斷、及產生該等抗體的融合瘤。
    在臟器移植醫療之中，為了抑制臟器移植後的排斥反應，在過去已有各種免疫抑制劑被使用。這種免疫抑制劑可列舉例如Tacrolimus(FK506)、環孢靈(Cyclosporin A)等(Jpn J Pharmacol,71,89-100,1996)。然而，就過去的免疫抑制劑而言，在癌細胞的增殖促進、骨髓機能抑制等強的副作用、感染症、甚至永續投予的必要性等方面會有問題(非專利文獻1：Transplantation,58,170-178,1994)。
    另外，一般而言免疫抑制劑難以判斷藥效消退的時期。例如即使不繼續投予免疫抑制劑，也會有組織生著的情形。在這種情況下，如果不慎繼續投予免疫抑制劑，則會有只對於患者造成毒性產生的傷害的顧慮。
    另一方面，因為中斷免疫抑制劑的投予，生著的組織也有可能發生排斥。在此情況下，即使重新開始投予免疫抑制劑也大多無法避免排斥。
    另一方面，關於臟器移植有各種研究正在進行。例如有文獻報告出在大鼠原位肝移植(OLT：orthotopic liver taransplantation)的系統之中，將移植片生著率高的供體DA大鼠肝(MHC haplotype RT1a)移植至受體PVG大鼠(RT1c)的情況，移植片可在未投予免疫抑制劑之下生著(非專利文獻2：Transplantation,35,304-311,1983)。
    另外有文獻報告出藉由將移植有DA大鼠肝的受體PVG大鼠的血清(post-OLT serum)在手術前投予1次至排斥反應發生的組合的移植模型系統，移植片的排斥反應會受到抑制(非專利文獻3：J. Surg. Res.,80,58-61,1998)。
    另外也有文獻揭示了藉由將抗組織蛋白H1多株抗體在手術後投予至必然發生排斥反應的DA(RT1a)以及LWIS大鼠(RT11)的心臟移植系統(in vivo)，可抑制排斥反應，受體能夠生存(非專利文獻4：Transplantation,77,1595-1603,2004)。
    另外，本發明人中的一部分揭示了藉由使用來自PVG大鼠移植後初期血清以抑制混合淋巴球培養反應(MLR；mixed lymphocyte reaction)；以及抗組織蛋白H1抗體表現出MLR抑制活性(專利文獻1：日本特開2004-149507號公報)。
    另外，本發明人中的一部分還揭示了一種抗組織蛋白H1單株抗體的製造；以及融合瘤16G9(寄存編號FERM BP-10413)所產生的抗組織蛋白H1單株抗體會與藉由噬菌體展示法所得到並由序列編號1所表示之胺基酸序列所構成之胜肽結合的現象(專利文獻2：WO2006/025580號公報)。
    此外，本發明人中的一部分還報告一種多株抗體的製造，該多株抗體係以由序列編號1所表示之胺基酸序列所構成之胜肽作為抗原(專利文獻3：US-2009-0081247-A1)。
    然而目前依然可說是需要創造出一種單株抗體，可利用於臟器移植中的移植排斥抑制，並且具有優異的免疫抑制活性。 先前技術文獻 非專利文獻
    非專利文獻1：Transplantation,58,170-178,1994
    非專利文獻2：Transplantation,35,304-311,1983
    非專利文獻3：J. Surg. Res.,80,58-61,1998
    非專利文獻4：Transplantation,77,1595-1603,2004 專利文獻
    專利文獻1：日本特開2004-149507號公報
    專利文獻2：WO2006/025580號公報
    專利文獻3：US-2009-0081247-A1
    本發明人等這次發現一種新的單株抗體，係具有顯著的免疫抑制活性；其抗原結合片斷；以及產生該等抗體的融合瘤。本發明基於這些見解而完成。
    因此本發明目的為提供一種新的單株抗體，其係具有顯著的免疫抑制活性；其抗原結合片斷；以及產生該等抗體的融合瘤。
    於是，本發明之單株抗體或抗原結合片斷，其係與SSVLYGGPPSAA(序列編號1)所表示之胺基酸序列所構成之胜肽或該胜肽與藥學上可容許的載體之結合體結合，且其特徵為：對於核心組織蛋白的結合親和性高於對於組織蛋白H1的結合親和性。
    另外，本發明之融合瘤會產生上述單株抗體或抗原結合片斷。
    本發明之單株抗體具有顯著的免疫抑制活性，而能夠有效利用在抑制臟器移植中的移植排斥。 寄存
    本發明之融合瘤Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3原寄存日為2010年8月17日，而寄存在獨立行政法人製品評估技術基盤機構專利微生物寄存中心(地址：日本千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8生物技術本部)，寄存編號為NITE BP-972。 單株抗體以及融合瘤
    本發明之單株抗體或其抗原結合片斷，係與由SSVLYGGPPSAA(序列編號1)所表示之胺基酸序列所構成之胜肽或該胜肽與藥學上可容許的載體之結合體結合，且對於核心組織蛋白的結合親和性高於對於連接組織蛋白(組織蛋白H1)的結合親和性為一項特徵。該具有反應性的單株抗體或其抗原結合片斷具有顯著的免疫抑制活性為令人意外的事實。
    依據本發明之合適的形態，上述抗體或其抗原結合片斷，係對應於由SSVLYGGPPSAA(序列編號1)所表示之胺基酸序列所構成之胜肽或該胜肽與藥學上可容許的載體。
    另外，依據本發明之合適的形態，核心組織蛋白為組織蛋白H2A、H2B、H3或H4，較佳為H2A、H3或H4。
    另外，本發明之抗體或其抗體結合片斷可含有重鏈及/或輕鏈。各輕鏈及重鏈其N-末端可具有可變區域，在各可變區域中，可交替含有4個架構區區域(framework region)(FR)與3個互補性決定區域(CDR)。可變區域中的殘基依據由Kabat等所設計的體系而慣用地加以編號。此體系為Kabat等在1987,Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Departement of Health and Human Services,NIH,USA所敘述。只要沒有特別指示，在本說明書中採用此編號體系。這種以Kabat等的方法為基準的編號，可使用例如網站http://www.bioinf.org.uk/abysis/tools/analyze.cgi而簡便地進行。
    Kabat殘基命名法未必直接與胺基酸殘基直線的編號一致。實際上直線的胺基酸序列，對應於基本可變區域構造之構造的要素、架構區或CDR之任一者的縮短或插入，而會發生具有比嚴謹的Kabat編號更少或額外增加的胺基酸的情形。殘基正確的Kabat的編號，應可藉由針對所提供的抗體，將經過「標準的」Kabat編號的序列與抗體的序列中的同源性殘基加以整理而決定。
    依據其中一個形態，本發明之抗體或其抗原結合片斷的輕鏈可變區域係含有由RASSSVSYMH(序列編號2)所表示之胺基酸序列所構成之CDR1、由ATSNLAS(序列編號3)所表示之胺基酸序列所構成之CDR2、及由QQWSSNPWT(序列編號4)所表示之胺基酸序列所構成之CDR3而成。依據更合適的形態，上述輕鏈可變區域係含有序列編號6的第23號～第128號所表示之胺基酸序列而成。
    另外，依據其他形態，本發明之抗體或其抗原結合片斷之重鏈可變區域係含有由GYNMN(序列編號7)所表示之胺基酸序列所構成之CDR1、由NINPYYGSTSYNQKFKG(序列編號8)所表示之胺基酸序列所構成之CDR2、及由SPYYSNYWRYFDY(序列編號9)所表示之胺基酸序列所構成之CDR3而成。依據更合適的形態，上述重鏈可變區域係含有序列編號11之第20號～第141號所表示之胺基酸序列而成。
    另外，依據本發明之更合適的形態，本發明之抗體或其抗原結合片斷係含有輕鏈可變區域與重鏈可變區域而成，而該輕鏈可變區域係含有由RASSSVSYMH(序列編號2)所表示之胺基酸序列所構成之CDR1、由ATSNLAS(序列編號3)所表示之胺基酸序列所構成之CDR2、及由QQWSSNPWT(序列編號4)所表示之胺基酸序列所構成之CDR3而成；該重鏈可變區域係含有由GYNMN(序列編號7)所表示之胺基酸序列所構成之CDR1、由NINPYYGSTSYNQKFKG(序列編號8)所表示之胺基酸序列所構成之CDR2、及由SPYYSNYWRYFDY(序列編號9)所表示之胺基酸序列所構成之CDR3而成。
    另外，依據本發明之更合適的形態，本發明之抗體或其抗原結合片斷係含有輕鏈可變區域與重鏈可變區域而成，而該輕鏈可變區域係含有序列編號6的第23號～第128號所表示之胺基酸序列而成；該重鏈可變區域係含有序列編號11之第20號～第141號所表示之胺基酸序列而成。
    另外，依據本發明之合適的形態，上述單株抗體或其抗原結合片斷可對ATP合成酵素活性作調降。另外，依據本發明之較合適的形態，上述ATP合成酵素係粒線體的ATP合成酵素。
    本發明之單株抗體或其抗原結合片斷之上述結合親和性及ATP合成酵素活性的調降活性可藉由例如本申請案說明書之測試例2及4所記載之方法作確認。
    另外，本發明之單株抗體宜為嵌合體抗體、人類型化抗體或完全人類型抗體。業界人士可基於例如Morrison,S. L.,Oi,V.T.,"immunoglobulin genes"Academic Press(London),260-274(1989)、Roguska,M.L. et. al.,Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing Proc,Natl. Acad. Sci,USA,91,969-973 (1994)、Tomizuka,K. et. al.,Functional expression and germline transmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice,Nature Genet.,16,133-143(1997)、Winter,G. et. al.,Making antibodies by phage display technology,Ann. Rev,Immunol.,12,433-455(1994)、Griffiths,A.D. et. al.,Isolation of high affinity human antibodies directly from Large synthetic repertoires,EMBO,J.,13,3245-3260(1994)等所記載該技術領域的周知技術而製造該等抗體。
    另外，依據本發明之合適的形態，上述抗原結合片斷宜為Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或scFv。
    另外，依據本發明之其他形態可提供一種融合瘤，其係產生上述單株抗體或其抗原結合片斷。另外，依據本發明合適的其他形態，融合瘤係Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3。
    本發明之單株抗體或其抗原結合片斷、及融合瘤能夠以例如以下的方式製造。亦即首先，本發明之融合瘤可藉由使用由SSVLYGGPPSAA(序列編號1)所表示之胺基酸序列所構成之胜肽或該胜肽與藥學上可容許的載體之結合體作為感作抗原，使對於此感作抗原免疫的哺乳動物之形質細胞(免疫細胞)與哺乳動物的骨髓瘤細胞融合，對於所得到的融合瘤進行選殖，由此融合瘤中篩選而得。然後本發明之單株抗體可藉由培養本發明之融合瘤，並回收其所產生的抗體而得到。
    使哺乳動物免疫的方法可採用在該技術領域中一般的投予法，具體而言，可列舉腹腔內注射、脾臟內注射、肌肉內注射、皮下注射、皮內注射、口服投予、經黏膜投予、經皮投予等，而宜為腹腔內注射、脾臟內注射。感作抗原的投予間隔係因應感作抗原的投予量及哺乳動物的種類等適當地決定，而可設定為例如每個月數次。
    經過免疫的哺乳動物並未受到特別限定，而以考慮細胞融合所使用的骨髓瘤細胞的適合性等而選擇為佳，可列舉例如小鼠、大鼠、倉鼠等，而宜為小鼠。
    另外，免疫細胞宜採用脾細胞。
    本發明所使用的骨髓瘤細胞可列舉例如P3(P3X63Ag 8.653)(J. Immunol.,123,1548,1978)、p3-U1(Current Topics in Micro-biology and Immunology,81,1-7,1978)、NS-1(Eur. J. Immunol.,6,511-519,1976)、MPC-11(Cell,8,405-415,1976)、Sp2/O-Ag14(Nature,276,269-270,1978)、FO(J. Immunol. Math.,35,1-21,1980)、S194(J. Exp. Med.,148,313-323,1978)、及R210(Nature,277,131-133,1979)等，而宜為P3或p3-U1，較佳為P3。
    免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合可依據例如密爾斯坦等(Milstein et. al.)的方法(Methods Enzymol.,73,3-46,1981)等進行。具體而言，細胞融合可例如藉由在融合促進劑的存在下，在培養基中將免疫細胞與骨髓瘤細胞混合而實施。於是在細胞融合之中，適當地添加培養基並重覆進行離心分離的操作，可產生融合瘤。
    細胞融合所使用的培養基可列舉例如RPMI-1640培養基、MEM培養基等在細胞融合之中通常使用的培養基。另外還可適當地併用牛胎兒血清(FBS)等血清補充液。
    另外，細胞融合溫度宜為25～37℃，較佳為30～37℃。
    此外，骨髓瘤細胞與免疫細胞之混合比率宜為1：1～1：10左右。
    融合促進劑可列舉例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，而宜為PEG。PEG的分子量可適當地選擇，可設定為例如平均分子量1,000～6,000左右。另外，培養基中之PEG之濃度宜為約30～60%(W/V)。
    另外還可依照需求而在培養基中適當地添加二甲亞碸等輔助劑。
    本發明之融合瘤的選擇，可藉由將藉由細胞融合所得到的融合瘤，以例如HAT培養基等通常的選擇性培養基(selective medium)進行培養，並使用通常的限數稀釋法，以對於例如由SSVLYGGPPSAA(序列編號1)所表示之胺基酸序列所構成之胜肽或該胜肽與藥學上可容許的載體之結合體的抗體價等作為指標進行篩檢而實施。藉由HAT培養基進行的培養時間，係足以使目標融合瘤以外的細胞(未融合細胞)滅亡所需的時間，通常可設定為數天至數週。以這種方式得到的本發明之融合瘤能夠以通常的培養基進行繼代培養，另外還可長期保存在液態氮中。
    另外，回收本發明之單株抗體或其抗體結合片斷的方法可列舉例如依據常法培養融合瘤，由其培養上清液得到單株抗體等的方法、或將融合瘤投予至與其具有適應性的哺乳動物，而使其增殖，由其腹水得到單株抗體等之方法等。此處，前者方法在得到高純度的抗體方面為適合，另一方面，後者方法在大量生產抗體方面為適合。
    進一步而言，本發明之單株抗體或其抗體結合片斷可藉由鹽析法、膠體過濾法、親和層析等方法高純度地精製。
    本發明之單株抗體或其抗原結合片斷如上述般，具有顯著的免疫抑制活性。本發明之單株抗體或其抗原結合片斷可直接使用，或可與藥學上所容許的添加劑等一起作為醫藥組成物使用。所以，依據本發明其中一個形態可提供一種醫藥組成物，其係含有本發明之單株抗體或其抗原結合片斷而成。另外，依據本發明合適的形態，上述醫藥組成物係使用作為免疫抑制劑。另外，依據本發明之其他形態還提供一種本發明之單株抗體之使用，其係用於醫藥組成物之製造。
    為了有利於抑制由於心臟、腎臟、肝臟、骨髓、皮膚等臟器的移植所發生的排斥反應或降低其發生風險，進一步治療自體免疫疾病等目的，而可利用本發明之醫藥組成物。本發明之醫藥組成物可例如使本發明之單株抗體溶於注射用生理食鹽水、注射用蒸餾水、注射用緩衝溶液等而調製。進一步在本發明之免疫抑制用組成物中，可含有適當的溶劑、溶解助劑、保存劑、安定劑、乳化劑、懸浮劑、無痛劑、等張化劑、緩衝劑、賦形劑、增黏劑、著色劑、周知的載體(各種核糖體、聚胺基酸載體、合成高分子、天然高分子等)等。
    另外，依據本發明之其他形態可提供一種方法，其係將免疫抑制視為必要的哺乳動物之治療方法，並包含投予有效量之本發明之單株抗體或其抗原結合片斷而成。此處，「治療」意指改善經確認發生的病情。另外，依據本發明之其他形態可提供一種方法，其係減輕移植排斥的發生風險的方法，並包含將有效量之本發明之單株抗體或其抗原結合片斷投予至接受臟器移植的哺乳動物而成。
    另外，依據其中一個形態，上述哺乳動物係接受臟器移植的動物。上述哺乳動物及移植臟器的供體可列舉人類、豬、狒狒等，而宜為人類。
    另外，所移植的臟器可列舉例如肝臟、心臟、腎臟、皮膚等。
    此外，本發明之單株抗體或其抗原結合片斷可與臟器移植所使用的其他免疫抑制劑組合，而同時或逐次投予至哺乳動物。該其他免疫抑制劑並未受到特別限定，而可列舉例如環磷醯胺等烷基化劑；硫唑嘌呤(Azathioprine)、胺甲葉酸(Methotrexate)、咪唑立賓(Mizoribine)等代謝拮抗劑；環孢靈(Cyclosporine)、他克莫司(Tacrolimus)等的T細胞活性阻礙劑；普賴蘇穠(prednisolone)、甲基普立朗(methylprednisolone)、霉酚酸酯(Mycophenolate mofetil)、硫唑嘌呤(Azathioprine)等類固醇劑；巴利昔單抗(Basiliximab)、鼠源單抗(Muromonab)等的淋巴球表面機能阻礙劑或該等的組合等。
    另外，本發明之單株抗體或其抗原結合片斷可全身或局部性地投予，具體的投予方法可列舉點滴、靜脈內注射、肌肉內注射、皮下注射、皮內注射、口服投予、經黏膜投予、經皮投予等。
    另外，本發明之單株抗體或抗原結合片斷的有效量並未受到特別限定，業界人士可因應哺乳動物的種類、性質、性別、年齡等而適當地決定。例如該有效量可列舉如0.05～40mg/體重kg/天，宜為0.1～1.0mg/體重kg/天，可1次投予或分成多次。 [實施例]
    以下列舉實施例對於本發明作具體說明，而本發明不受該等實施例所限定。 實施例1：單株抗體(SSVmAb)之製造 抗原物質之製造
    抗原物質採用序列由編號1所表示之胺基酸序列所構成之胜肽及KLH之結合體。
    在調製抗原物質方面，首先藉由Fmoc胜肽固相合成法(製造裝置；ABI430型Applied Biosystems公司製)所合成出由序列編號1所表示之胺基酸序列所構成之胜肽。接下來將上述胜肽5mg、KLH約20mg及戊二醛30μg(片山化學工業股份有限公司)在磷酸緩衝液(PH8.0)中，在室溫攪拌約6小時而合成上述胜肽及KLH(SIGMA公司製)的結合體。 融合瘤之製造 免疫
    將PBS中溶有抗原物質所得的溶液0.8mL(抗原物質濃度：0.5mg/mL)與佛氏佐劑(和光純藥股份有限公司製)0.8mL加以混合，而得到懸浮液(抗原濃度：0.25mg/mL)。接下來將此懸浮液0.2mL投予至BALB/c小鼠腹腔內。進一步將此懸浮液每2週以相同的量投予至小鼠。然後在投予開始的16週後，將PBS中溶有抗原所得的溶液0.2mL(抗原濃度：600～1000mg/mL)投予至小鼠腹腔內，作為最後的投予。此外，在投予時由眼底靜脈進行採血，並藉由ELISA測定抗體價。在最後的投予的4天後，進行全採血，將所得到的血液離心分離(2000rpm，20分鐘)，而得到抗血清，並使用作為以下實驗的控制組抗血清。另外，在全採血後，將脾臟由大鼠摘出，並將所得到的脾細胞使用於以下的細胞融合。 細胞融合
    將上述脾細胞及骨髓瘤細胞(P3X63-Ag,8.653)，以脾細胞：骨髓瘤細胞=10：1～10加以混合，離心分離(1500rpm，5分鐘)。離心分離之後，使用抽氣機除去上清液，在所得到的細胞粒中花費1分鐘添加37℃的聚乙二醇4000(50%PBS溶液)1mL而製成混合液。將此混合液在37℃靜置1分鐘之後，以每30秒1mL加入37℃的IMDM培養基(合計9mL)之後，進行離心分離(1500rpm，5分鐘)。離心分離後，將上清液吸除，適量添加37℃的含有15%FCS(JRH BIOSCIENCES製)的IMDM(GIBCO製)培養基。將所得到的懸浮液以各100mL分注至96孔培養盤，在37℃/5%CO2培養箱培養1天。進一步添加100mL的HAT培養基(使HAT粉末(HAT MEDIA SUPPLEMENT(×50)，SIGMA製)溶於無血清的IMDM培養基10mL，並以含有10%FCS的IMDM培養基稀釋50倍而得)，並在37℃/5%CO2培養箱培養。每2～3天進行HAT培養基的更換，在10天後改用HT培養基(使HT粉末(HT MEDIA SUPPLEMENT，SIGMA製)溶於無血清的IMDM培養基10mL，並以含有10%FCS的IMDM培養基稀釋50倍而得)，並在37℃/5%CO2培養箱進行培養3天。以後每2～3天進行培養基(HT培養基)的更換。藉由顯微鏡確認細胞增殖之後，回收培養上清液(約100mL)。使用此培養上清液，藉由抗體價測定進行融合瘤的篩檢。 融合瘤細胞的篩檢 抗體價測定
    將含上述抗原物質(5mg)的緩衝液(Baicarbonate buffer：100mM NaH CO3-NaOH、pH9.2～9.5、胜肽濃度：1μg/mL)以每孔50μL添加至96孔平底盤，並在室溫靜置2小時進行固著(coating)。將孔盤以洗淨緩衝液(PBST)洗淨3次，並以200～250μL/孔加入阻斷緩衝液(3%脫脂牛乳1%BSA、PBS)，在4℃反應一晝夜之後，洗淨3次。然後以100μL/孔加入融合瘤的培養上清液，在37℃反應4小時或在4℃反應一晝夜。將孔盤洗淨3次之後，以50μL/孔加入以稀釋緩衝液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.9%(W/V)NaCl、0.05%(W/V)Tween20)稀釋10000倍的生物素標識抗小鼠IgG(Biotion-labeled anti-mouse IgG、SIGMA)，並在室溫使其反應2小時。其後洗淨6次之後，以50μL/孔加入以稀釋緩衝液稀釋1000倍的鹼性磷酸酶標識卵白素(Streptaridin)，並在室溫使其反應1～2小時。其後進行洗淨6次，以50μL/孔加入螢光基質緩衝液(Attophos substrate buffer，Roche-Diagnostics公司製)，將孔盤遮光，並使其發色。螢光強度係以CytoFluorII(PerSeptive公司製)作測定。 融合瘤的篩選
    在上述抗體價測定呈現陽性結果的孔(1×105細胞/mL)中，加入含有15%FCS10%HCF(Hybridoma cloning factor，Origen公司製)的IMDM培養基，以成為約200細胞/孔的方式分注至96孔培養盤，並在37℃ 5%CO2培養箱進行培養。然後與上述同樣的方式進行抗體價測定，並選擇抗體產量高的融合瘤。
    進一步進行限數稀釋，以使所選擇的融合瘤成為0.5～1細胞/孔的方式以含有15%FCS10%HCF的IMDM培養基稀釋，在37℃/5%CO2培養箱培養約3～4天之後，以與上述同樣的方式進行抗體價測定，並選擇抗體產量高的融合瘤。進一步重覆進行限數稀釋，而得到可產生對應於上述抗原物質的單株抗體之融合瘤。選擇其中抗體價最高的融合瘤，並命名為Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3。 單株抗體的取得
    融合瘤Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3係使用含有15%FCS的RPMI培養基進行培養(1×106細胞/mL)。接下來，回收融合瘤培養液，為了除去死亡的細胞片而以過濾器進行過濾。接下來，以終濃度成為40%的方式在培養上清液中加入硫酸銨，並在40℃攪拌1小時。接下來進行離心分離(3000g、30分鐘、4℃)，將上清液捨棄而回收沉澱。使此沉澱溶於上述培養上清液1/10量的PBS，以PBS作為外液透析一晚。
    接下來，將上述沉澱以20mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)稀釋2倍，與1M Tris-HCl緩衝液一起添加至經HiTrapNHS活化的管柱。進一步以0.1M甘胺酸-HCl溶液(pH2.7)使抗體溶出、回收至集液管。 測試例1：SSVmAb的亞型的鑑定
    為了鑑定實施例1之單株抗體(SSVmAb)之亞型，使用Mouos Monoclonal Antibody Isotyping Reagents(SIGMA)進行亞型鑑定測試。
    結果如圖1所示般，IgG1表現出最高的值。
    另外，將小鼠IgG1(eBioscience公司)及實施例1之單株抗體(SSVmAb)，以2-巰乙醇還原，以SDS-PAGE處理的結果，任一者皆可在同樣的位置(50KD、25KD)確認出相當於重鏈及輕鏈的條帶(band)。另一方面，使用小鼠IgM(eBioscience公司)代替小鼠IgG1進行同樣的實驗，結果並未確認出同樣的條帶。
    圖1及SDS-PAGE的結果看來，可確認實施例1之單株抗體(SSVmAb)之亞型為IgG1。 測試例2：SSVmAb對於核心組織蛋白的親和性的確認
    在WO2006/025580號公報中，報告了一種由融合瘤16G9(寄存編號FERM BP-10413)所產生的單株抗體(16G9mAb)以作為可使用於免疫抑制，並與由序列編號1所表示之胺基酸序列所構成之胜肽結合之抗H1單株抗體。
    於是，將WO2006/025580號公報所記載之抗體(16G9mAb)定為參考例1，並與實施例1的單株抗體(SSVmAb)對於抗原的親和性進行比較。
    作為抗原選擇了參考例1(16G9mAb)的抗原之組織蛋白H1、及組織蛋白H1類似抗原的核心組織蛋白H2A、H2B、H3及H4。
    以ELISA決定組織蛋白H1或核心組織蛋白與SSVmAb的親和性。
    以組織蛋白H1、H2A、H2B、H3或H4塗覆96well微量盤。各個組織蛋白採用溶於100mM碳酸鈉緩衝液(pH9.3)所得之物。將此盤以PBS-tween20(0.05%)洗淨，以3%脫脂牛乳與1%BSA阻斷1小時。將SSVmAb 5 μg/mL添加至各well，並保溫1小時。對於結合後的SSVmAb使用過氧化酶(HRP)結合的anti mouse IgG1 Ab(SIGMA)進行偵測，並保溫1小時。使用ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-sulfonic acid)]基質溶液偵測結合後的SSVmAb，並使用Multiskan Ascent(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA)測定405nm之吸光度。
    結果如圖2及3所示。
    如圖2所示般，在實施例1(SSVmAb)中，對於組織蛋白H2A、H2B、H3或H4的親和性高於對於組織蛋白H1的親和性。
    另一方面如圖3所示般，在參考例1(16G9)中，對於組織蛋白H1的親和性高於對於組織蛋白H2A、H2B、H3及H4的親和性。 測試例3：MLR測試
    使用來自無處理的DA大鼠的脾臟淋巴球(應答細胞)及來自經過絲裂霉素C(協和發酵工業股份有限公司製)處理的LEW大鼠的脾臟淋巴球(刺激細胞)。應答細胞係以10%FCS-RPMI培養基調製成5×105細胞/mL，刺激細胞係以10%FCS-RPMI培養基調製成8×106細胞/mL。分別將此應答細胞懸浮液及刺激細胞懸浮液100μL接種至96孔圓底盤(Nunc Brand Products公司製)之後，在混合培養開始時添加參考例1之單株抗體16G9mAb(0.1、2、4或6μg/mL/孔)或實施例1之單株抗體SSVmAb(4μg/mL/孔)，在37℃、5%CO2/95%air的條件下培養3.5天以上。另外，作為陽性對照組添加了免疫抑制劑他克莫司(Tacrolimus)(FK506：藤澤藥品公司製，1nM/孔)。進一步在培養結束15小時前，添加10μL的溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)。然後使用BrdU標定檢測套組(BrdU Labeling and Detection Kit III)(Roche-Diagnostics公司製)，以被收進細胞內DNA的BrdU量作為指標，測定出經過免疫抑制物質處理的細胞的增殖能力，定為免疫抑制等級的指標。
    結果如圖4所示。
    在實施例1(SSVmAb)的情況中，代表BrdU吸收量的吸光度係低於與參考例1(16G9mAb)及Tacrolimus(FK506)。若特別將實施例1(SSVmAb)的吸光度為0.552±0.114(平均±S.E.)與同添加量(4μg/mL/孔)之參考例1(16G9mAb)之吸光度1.351±0.389(平均±S.E.)加以比較，則實施例1的平均值為參考例1的值約41%左右。 測試例4：單株抗體(SSVmAb)對於T細胞的反應性的確認
    藉由以下的方法，由C57BL/6小鼠(5週齡、雌性、日本Charles River公司製)摘出脾臟，而調製出全脾細胞。
    首先，在加入5mL的RPMI1640培養基(Sigma-Aldrich公司製R-8758)的5ml培養皿(BD Bioscience公司製FALCON351007)中，以解剖用剪刀與鑷子將脾臟充分解碎並使脾細胞懸浮後，移至15ml離心管(BD Bioscience公司製FALCON 352096)。接下來，在5mL培養皿上，以phosphate-buffered saline(PBS，Invitrogen公司製20012-027)洗淨數次，該等亦與先前的細胞懸浮液加在一起並且靜置後，將上清液回收至另一個15ml離心管。進一步在殘渣的不溶性脾臟組織中，再度加入5ml的RPMI1640培養基，靜置後，僅回收上清液，將其與上述細胞懸浮液混合，以1,500rpm、5min進行離心分離。在所回收的細胞中加入2ml的lysis buffer(150mM NH4Cl/15mM NaHCO3/0.1mM EDTA-Na2,pH7.3)，輕輕拍打試管使其溶血後，加入PBS 10ml，並以1,500rpm、5min離心洗淨3次，將所得的細胞定為全脾細胞。
    接下來，依據以下所記載之方法，使用Pan T Cell Isolation Kit,mouse(Miltenyi Biotec公司製130-090-861)，並藉由磁性細胞分選技術(MACS)而由此脾細胞精製出全T細胞。
    首先使脾細胞以5×107cells/200μl的比例懸浮於MACS buffer(0.5%bovine serum albumin(BSA，Nacalai Tesque公司製08777-36)/PBS)，添加50μL的Biotin-antibody cocktail/5×107cells，並在4℃保溫10min。使其懸浮於150μL的MACS buffer/5×107cells之後，添加100μL的anti-biotin micro beads/5×107cells，在4℃保溫15min。於其中添加MACS buffer(10ml)，以1500rpm離心洗淨5min後，使回收的細胞懸浮於500μl的MACS buffer。將MACS管柱(MS管柱、Miltenyi Biotec公司製130-042-201)設置於磁場中(MiniMACS separation Unit，Miltenyi Biotec公司製130-090-312)，以500μl MACS buffer使管柱平衡化後，對其供應上述細胞懸浮液。將通過的分離物500μL及其後藉由MACS buffer進行管柱洗淨所得的分離物(1.5ml)加以回收，定為精製未刺激T細胞(純度約97%)。
    藉由流式細胞儀(FACS)解析上述未刺激與16G9 mAb或與SSV mAb之反應性。
    首先，使各T細胞試樣(1×106cells)懸浮於89μL的FACS buffer(0.5%FBS/PBS/0.02%NaN3)之後，加入1μg的anti-mouse CD16/32-blocks Fc binding(eBioscience公司製14-0161-85)，並在4℃保溫20min。以此作為1次抗體，加入10μl的16G9 mAb或SSV mAb(100 μg/ml)，在4℃保溫60min。以FACS buffer將細胞離心洗淨2次後，加入100μl的2次抗體(Biotin-conjugated rat anti-mouse IgM mAb(eBioscience公司製13-5780-85)或Biotin-conjugated rat anti-mouse IgG1 mAb(BD Biosciences公司製553441)、各1μg/ml)，並在4℃保溫30min。再度以FACS buffer將細胞離心洗淨2次後，加入100μl的Streptavidin-PE-Cy7(BD Biosciences公司製556463，1μg/ml)，於其中以終濃度成為1μg/ml的方式添加FITC-conjugated rat anti-mouse CD3 mAb(BD Biosciences公司製553062)，並在4℃培養30min。以FACS buffer離心洗淨2次，及以40μm細胞過濾器(BD Bioscience公司製FALCON 352340)過濾處理後，將各試樣供給至FACSCalibur流式細胞儀及CellQuest軟體(BD Bioscience公司製)，並解析16G9 mAb或SSV mAb陽性/CD3陽性T細胞數。
    結果如圖5所示。
    若將參考例1(16G9 mAb)及實施例1(SSV mAb)加以比較，則對於CD3陽性T細胞的反應性並未觀察到明顯差異，該等抗體會表現出同等的反應性(student t-test，P＜0.05)。 試驗例5：藉由SSV mAb進行調降(down-regulation)的目標之特定
    以蛋白質體(Proteome)解析，鑑定7種藉由實施例1(SSV mAb)調降的候選蛋白質。
    然後在7種候選蛋白質之中，藉由以下的方法作確認ATP合成酵素為實施例1(SSV mAb)之目標抗原。
    首先，使用Thermo Fisher公司的Accell siRNA套組，取得來自粒線體ATP合成酵素受到擊低(knock-down)後的Balb/c小鼠的T細胞。
    接下來，依據測試例2的方法，使用所得到的T細胞，以實施例1(SSV mAb)作為測試物質進行MLR測試。
    此處，對照試藥採用Isotype IgG1(eBioscience公司)。另外，控制組的測試係採用來自並未將ATP合成酵素擊低的小鼠的T細胞，進行同樣的測試。
    結果如圖6A及B所示。
    圖6A所記載般，在並未將ATP合成酵素擊低的情況中，實施例1(SSV mAb)與Isotype IgG1加以比較，實施例1明顯較能夠阻礙細胞增殖。
    另一方面，如圖6B所記載般，在將ATP合成酵素擊低的情況，關於細胞增殖的阻礙，在實施例1(SSV mAb)與Isotype IgG1之間並未觀察到顯著差異。
    在圖6A及B中，因為ATP合成酵素的擊低而降低了SSV mAb的免疫抑制活性，而提示了SSV mAb在會免疫抑制時調降ATP合成酵素活性。
    測試例6：SSV mAb的輕鏈及重鏈可變區域序列的鑑定融合瘤cDNA之合成
    使用FastPure RNA Kit(TaKaRa公司製)，由測試例1所取得的融合瘤(Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3)1.6×107cells調製出total RNA。使用Poly(A)+Isolation Kit from Total RNA(NIPPON GENE製)，由240μg的total RNA調製出mRNA。使用Etachinmate(NIPPON GENE公司製)進行乙醇沉澱，而使mRNA沉澱。以75%乙醇洗淨之後，將mRNA乾燥。於其中加入10μL的RNase free water，以使mRNA溶解。所得到的mRNA溶液保存在-80℃。使用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司製)，由1μg的SSV融合瘤mRNA合成出5'-RACE用的cDNA。所得到的cDNA溶液保存在-20℃。 SSV mAb輕鏈及重鏈中的互補性決定區域(CDR)的鑑定
    以小鼠IgG1重鏈恆定區域之鹼基序列為基礎，製作出引子5'-CAC CAT GGA GTT AGT TTG GGC AGC AG-3'(序列編號12)。以小鼠輕鏈κ恆定區域之鹼基序列為基礎製作出引子5'-CAC GAC TGA GGC ACC TCC AGA TG-3'(序列編號13)。使用各個引子與Universal Primer A Mix(SMARTer RACE cDNA Amplification Kit附屬引子)，進行以cDNA作為模板的5'-RACE。RACE反應係採用Advantage2 PCR Kit(Clontech公司製)。對反應液實施瓊脂糖電泳，使用E.Z.N.A. Gel Extraction Kit(OMEGA bio-tek公司製)由膠體精製出約600 bp的重鏈5'-RACE產物及約550 bp的輕鏈5'-RACE產物。將其連結至pGEM-T Easy Vector(Promega公司製)，並轉殖至Competent high E.coli DH 5α(TOYOBO公司製)。使用E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit I(OMEGA bio-tek公司製)，由所得到的轉殖體調製出質體。以所調製出的質體作為模板，使用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司製)進行循環反應。
    接下來，將使用DNA定序儀(Applied Biosystems製)解析輕鏈及重鏈可變區域的鹼基序列。
    其結果，輕鏈可變區域的鹼基序列係以序列編號5之第67號～第384號表示。
    另外，重鏈可變區域之鹼基序列係以序列編號10之第58號～第423號表示。
    此外，基於轉譯起始密碼子與藉由Kabat等的方法所決定的FR(恆定區域)1的位置，而推測序列編號5的第1號、第66號為輕鏈的訊號胜肽之鹼基序列，及序列編號10的第1號～第57號為重鏈的訊號胜肽之鹼基序列。
    接下來，由所得到的鹼基序列推測輕鏈及重鏈可變區域的胺基酸序列，依據Kabat等的方法鑑定CDR區域。
    其結果，輕鏈可變區域的胺基酸序列係以序列編號6的第23號～第128號表示。此處，序列編號6的第1號～第22號為輕鏈的訊號胜肽之胺基酸序列。
    另外還確認了輕鏈可變區域可變區域的胺基酸序列之中，CDR1係以RASSSVSYMH(序列編號2)表示，CDR2係以ATSNLAS(序列編號3)表示，CDR3係以QQWSSNPWT(序列編號4)表示。
    另外，重鏈可變區域的胺基酸序列係以序列編號11之第20號～第141號所表示。此處，序列編號11之第1號～第19號為重鏈的訊號胜肽之胺基酸序列。
    另外還確認了重鏈可變區域的胺基酸序列之中，CDR1係以GYNMN(序列編號7)表示，CDR2係以NINPYYGSTSYNQKFKG(序列編號8)表示，CDR3係以SPYYSNYWRYFDY(序列編號9)所表示。
    <110>　Josaiuiversity corporation
    <120>　具有免疫抑制活性的單株抗體或其抗原結合片斷
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    圖1係表示本發明之單株抗體(以下亦稱為「SSV mAb」)之亞型鑑定測試的結果。
    圖2表示將本發明之單株抗體(SSV mAb)結合於組織蛋白H1、組織蛋白H2A、H2B、H3或H4的結合親和性加以比較的測試結果。
    圖3為參考例；表示將由寄存編號為FERM BP-10413而寄存的融合瘤16G9所產生的單株抗體(以下亦稱為「16G9 mAb」)結合於組織蛋白H1、組織蛋白H2A、H2B、H3或H4的結合親和性加以比較的測試結果。
    圖4表示使用本發明之單株抗體(SSV mAb)及16G9 mAb的混合淋巴球反應(MLR)測試的結果。
    圖5表示藉由流式細胞儀將本發明之單株抗體(SSV mAb)及16G9 mAb對於T細胞的反應性加以比較的結果。
    圖6A表示關於本發明之單株抗體(SSV mAb)及對照試藥(Isotype IgG1)，使用ATP合成酵素並未受到siRNA擊低的脾臟細胞所作的MLR測試的結果。B表示關於本發明之單株抗體(SSV mAb)及對照試藥(Isotype IgG1)，使用將ATP合成酵素藉由siRNA擊低的脾臟細胞所作的MLR測試的結果。
    权利要求:
    Claims (22)
    [1] 一種單株抗體或其抗原結合片斷，其係與由SSVLYGGPPSAA(序列編號1)所表示之胺基酸序列所構成之胜肽或該胜肽與藥學上可容許的載體之結合體結合之單株抗體或其抗原結合片斷，其特徵為：對於核心組織蛋白的結合親和性高於對於組織蛋白H1的結合親和性。
    [2] 如申請專利範圍第1項之單株抗體或其抗原結合片斷，其係對應於由SSVLYGGPPSAA(序列編號1)所表示之胺基酸序列所構成之胜肽或該胜肽與藥學上可容許的載體。
    [3] 如申請專利範圍第1或2項之單株抗體或其抗原結合片斷，其係含有輕鏈可變區域而成，該輕鏈可變區域係含有由RASSSVSYMH(序列編號2)所表示之胺基酸序列所構成之CDR1、由ATSNLAS(序列編號3)所表示之胺基酸序列所構成之CDR2、及由QQWSSNPWT(序列編號4)所表示之胺基酸序列所構成之CDR3而成。
    [4] 如申請專利範圍第1～3項中任一項之單株抗體或其抗原結合片斷，其中前述單株抗體或其抗原結合片斷之輕鏈可變區域係含有序列編號6之第23號～第128號所表示之胺基酸序列而成。
    [5] 如申請專利範圍第1～4項中任一項之單株抗體或其抗原結合片斷，其係含有重鏈可變區域而成，該重鏈可變區域係含有由GYNMN(序列編號7)所表示之胺基酸序列所構成之CDR1、由NINPYYGSTSYNQKFKG(序列編號8)所表示之胺基酸序列所構成之CDR2、及由SPYYSNYWRYFDY(序列編號9)所表示之胺基酸序列所構成之CDR3而成。
    [6] 如申請專利範圍第1～5項中任一項之單株抗體或其抗原結合片斷，其中前述單株抗體或其抗原結合片斷之重鏈可變區域係含有序列編號11之第20號～第141號所表示之胺基酸序列而成。
    [7] 如申請專利範圍第1～6項中任一項之單株抗體或其抗原結合片斷，其係調降ATP合成酵素活性。
    [8] 如申請專利範圍第1～7項中任一項之單株抗體或其抗原結合片斷，其中前述單株抗體係嵌合體、人化、或人類抗體。
    [9] 如申請專利範圍第1～8項中任一項之單株抗體或其抗原結合片斷，其中前述核心組織蛋白係選自組織蛋白H2A、H2B、H3及H4之至少一者。
    [10] 如申請專利範圍第1～9項中任一項之單株抗體或其抗原結合片斷，其中前述藥學上可容許的載體係鑰孔蟲戚血藍蛋白(Keyhole limpet hemocyanin)、卵蛋白素或牛血清蛋白素。
    [11] 如申請專利範圍第1～10項中任一項之單株抗體或其抗原結合片斷，其係藉由融合瘤Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3所產生。
    [12] 如申請專利範圍第1～11項中任一項之單株抗體或其抗原結合片斷，其中前述抗原結合片斷係Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或scFv。
    [13] 一種醫藥組成物，其係含有如申請專利範圍第1～12項中任一項之單株抗體或其抗原結合片斷而成。
    [14] 如申請專利範圍第13項之醫藥組成物，其係作為免疫抑制劑使用。
    [15] 如申請專利範圍第13或14項之醫藥組成物，其係使用於抑制移植排斥或降低其發病風險。
    [16] 一種融合瘤，其係產生如申請專利範圍第1～12項中任一項之單株抗體或其抗原結合片斷。
    [17] 如申請專利範圍第16項之融合瘤，其係融合瘤Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3。
    [18] 一種如申請專利範圍第1～12項中任一項之單株抗體或其抗原結合片斷之使用，其係用於醫藥組成物之製造。
    [19] 如申請專利範圍第18項之使用，其中前述醫藥組成物係免疫抑制。
    [20] 如申請專利範圍第18或19項之使用，其係用於醫藥組成物之製造，前述醫藥組成物係使用於抑制移植排斥或降低其發病風險。
    [21] 一種方法，其係將免疫抑制視為必要的哺乳動物之治療方法，其特徵為：包含將有效量的如申請專利範圍第1～12項中任一項之單株抗體或其抗原結合片斷投予至哺乳動物而成。
    [22] 一種方法，其係減輕移植排斥的發生風險之方法，其特徵為：包含將有效量的如申請專利範圍第1～12項中任一項之單株抗體或其抗原結合片斷投予至接受臟器移植的哺乳動物而成。
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    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP2010185406||2010-08-20||
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